Музей-заповедник основан в 2000 году по постановлению Правительства Свердловской области. Он является наследником Верхотурского краеведческого музея, открытого в 1921 году, расформированного в середине 30-х годов и воссозданного в 1977 году. В состав фондов музея-заповедника вошли коллекции краеведческого музея и ряд объектов культурного наследия федерального и областного уровня.
Музей расположен в историческом центре города Верхотурье и включает в себя Верхотурский кремль на Троицком камне над рекой Турой и Дом для приема почетных гостей на левом берегу реки Калачик – притоке Туры. В комплекс Верхотурского Кремля входят пять памятников архитектуры и градостроительства: Свято-Троицкий собор (1703–1710 гг.); Дом воеводы (1801 г.); Приказные палаты (1825–1830 гг); Уездное казначейство (1913 г.); Государевы амбары (1703 г., перестроены в 1913–1914 гг.).
В ходе реализации областной государственной программы «Верхотурье – Духовный центр Урала» будет воссоздан и отреставрирован ряд объектов как на территории кремля, так и в исторической части города.